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生命科学毕业生论文

2017-07-21 10:38 本文地址:http://www.qwqk.net/news4531.html 人气:2719

 关键词:毛细管电泳

  随着生物化学与分子生物学及生物医学研究的日益深入,研究人员对与生命现象有关的分子的分离分析技术提出了愈来愈高的要求。本文就近年来发展的毛细管电泳及其在生命科学中的应用作些介绍。

  1.毛细管电泳仪简介

  毛细管电泳仪商品虽然外型各异,但不外乎由下列几个部分构成:1.毛细管;2.高压电源;3.电极及电极液;4.在线检测器;5.恒温装置;6.样品盘;7.数据收集和处理系统(记录仪、积分仪、电脑)。

  毛细管是由熔融石英加工制得,为克服石英极脆易断的缺点,在其外壁涂抹了一层聚亚胺酷以增加毛细管的柔性。检测器位于距样品盘约毛细管总长的三分之二至五分之四处,对毛细管壁内部分进行光学聚焦。在线检测器有紫外、荧光和激光等多种检测方式,目前较为常见的是紫外检测。此外,将毛细管电泳仪和质谱仪联用也已见报道。

  毛细管中充满具有一定离子强度的缓冲液后,在其两端加上高电压,被分析物除受电场力的作用外,还受电渗流作用。毛细管内壁的石英分子在一般水性环境中(pH2.0以上)因HZSIO3分子的解离,其表面形成一层负电荷,吸引缓冲液中的正离子,这一层正离子在电场的作用下趋向阴极,从而带动毛细管内整个溶液向阴极移动。此电渗现象在毛细管电泳中起着举足轻重的作用。虽然被分离的混合物中各分子在特定的电泳缓冲液中带有不同的净电荷,但在电渗作用下均向阴极方向泳动。其最终的迁移力由电渗、缓冲液条件及分子本身的泳动力决定。其中泳动力和分子的荷质比有关。

  内壁石英分子除能造成电渗流外,还具有吸附溶质中带正电荷分子的能力,从而会影响分离效果。为避免分析物被管壁吸附,可选用缓冲液的pH大于样品混合物中蛋白质和多肤的等电点,此时被分析物与管壁带同种电荷;或者选用pH接近pHZ.o,此时毛细管内壁无解离的负电荷,但此酸性环境易造成蛋白质变性失活,一般仅用于多肤分析。也可对毛细管内壁进行涂层,如中性共价涂层以消除电渗,或采用改变内壁电荷的极性的可逆涂层方法,适于等电点偏高的蛋白质的分离分析。

  与平板凝胶电泳手工上样方式不同,毛细管电泳采用两种自动进样方式:流体静力进样(通过压力推动或真空吸入)和电动进样。每次进样量为几纳升,一般仅可用于分析鉴定。如要收集分离产物并进行进一步研究,则需重复多次分析以富集分离到的产物。1992年Huang和Mathies等报道毛细管束电泳的实验结果,数十乃至上百根毛细管平行排列,分离得到的产品产量能提高二个数量级。

  2.毛细管电泳的几种分离模式

  毛细管电泳根据分离机理等不同,类似于液相色谱的归类,分成几种分离模式,主要为以下几种:

  2.1.自由溶液毛细管电泳(FSCE)或称

  毛细管区带电泳(CZE)毛细管中只充有电泳缓冲液,根据被分析物的荷质比差异进行分离。应用最广泛、已见报道的例子有多肤、蛋白质和核酸等生物大分子的分离以及无机离子、氨基酸、药类等小分子的分析。

  2.2.毛细管等电聚燕(CIEF)根据蛋

  白质和多肤的等电点进行分离。需选用内壁中性共价涂层的毛细管,阳极端至检测器有效分离部分(离检测窗口差几厘米)充满两性电解质溶液,样品溶液夹在其中以避免直接接触阳极液(H3P04)。毛细管其余部分(检测器至阴极)为阴极液(NaOH溶液)。毛细管两端分别插入阳极和阴极液中,其中毛细管中的溶液和H3PO‘溶液中均含一定浓度的可溶性甲基纤维素作为支持介质。两性电解质载体和样品在电场中聚焦至电流趋于零,通过压力或在正负极加盐等方式,不同等电点的样品逐一经过检测窗口。此方法除了能测定蛋白质和多肤的等电点外,还可鉴定蛋白质的纯度及分析不同变异体。毛细管等电聚焦具有比凝胶等电聚焦更高的分辨力,即使选用广范围的两性电解质(PH3~10),也可分辨相差一个净电荷的天然蛋白质和其突变体。由于是直接在线检测,可分析多肤的等电点,而在传统凝胶等电聚焦中的固定、染色、脱色等步骤中小分子多肤易丢失。整个分析过程可自动化,通常仅需45分钟左右。

  2.3毛细管凝胶电泳(CGE)根据被分

  析物的荷质比分离,当凝胶中含有SDS等去垢剂时,则根据它们的分子大小进行分离。主要用于蛋白质、部分多肤和DNA分离。毛细管内的分离介质可以如平板电泳一样呈凝胶状,也可以是甲基纤维素溶液,后者便于清洗,可实现毛细管一管多用。溶液中的甲基纤维素分子在电子显微镜中呈现缠绕状,其作用机理类似于凝胶的筛网作用。

  2.4.微团电动毛细管色谱(MECC)

  在电泳缓冲液中加人一定浓度的去垢剂,如SDS及其类似物,这些分子一端为亲水基团,其余部分为疏水结构,在溶液中聚集成一个个微团,称为假固相,被分析的样品根据其在假固相和溶液相中的分配进行分离。此方式主要用于小分子(如氨基酸等)和多肤的分离。

  3.毛细管电泳在生命科学中的应用

  3.1.在多肤研究中的应用

  毛细管电泳可以分辨多肤的细微结构差异,如C一端的酞胺化与去酞胺化,单个氨基酸残基的替换,氨基酸组成相同而序列不同的多肤也能区别开,甚至表面电荷不同而一级结构相同的多肤也有可能分离开。另外用FSCE有时能帮助确定多肤内是否存在二硫键。

  3.2.在蛋白质研究中的应用

  毛细管电泳采用温和非变性条件,有利于分析蛋白质的细微结构差异并鉴定蛋白质的纯度。例如核糖核酸酶A、Bl和BZ一级结构相同,差别在于第34位天冬酞胺残基上糖基化程度不同。选择一定的电泳条件可将这三种异构体分开。已知不少遗传工程重组蛋白需含有与其天然蛋白一样的特定多糖,毛细管电泳可监控它们所结合多糖的均一性。毛细管电泳最近被用来研究细胞色素C的结构与功能。Albin等报道了用毛细管电泳研究其表面修饰的位点。他们监测了修饰反应过程,比较了修饰前后的胰蛋白酶酶解肤谱,并收集了含有被修饰残基的肤段,测定其序列,确定了修饰试剂钉复合物所结合的残基。

  由于毛细管电泳分析快速,可用来监测蛋白质化学反应的动力学过程。如分析RNase蛋白酶解产物中含糖肤段去糖昔化的动力学过程。我们实验室建立了用毛细管电泳测定蛋白激酶A活性的方法,其灵敏度、精确性和线性范围均不亚于经典的同位素法。

  除了自由溶液毛细管电泳外,毛细管等电聚焦和毛细管凝胶电泳在蛋白质研究方的应用例子也很多。Chen等报道了应用毛细管等电聚焦测定RNase几种变异体的等电点,它们都接近pH梯度的极端值,如RNaseA,Pl9.5;RNaseBa,pl9.0;RNaseTl,pl3.0,以往用凝胶IEF较难测准。图1为我们实验室应用CIEF测定重组人表皮生长因子(rhEGF)的等电点,经分析其pl为5.0。

  应用毛细管SDS凝胶电泳可以比较方便地分析糖蛋白的分子量。由于多糖基团不结合SDS,糖蛋白的荷质比相对于同样大小的蛋白质低,用经典的SDS一聚丙烯酞胺凝胶电泳估计的分子量偏大,通常必须在不同浓度的凝胶上进行分析,得到糖蛋白迁移率对数值相对于凝胶浓度的线性关系图(Ferguson图),该直线的斜率称为此蛋白的排

  组系数Kr。Kr和蛋白质的半径的平方成正比,而蛋白质半径与其分子量的对数成线性,因此得到标准蛋白分子量的fog值相对于Kr平方根的线性关系图,测得糖蛋白的Kr值即可推测其分子量。运用传统的平板凝胶电泳需多次灌胶多次电泳,而毛细管凝胶电泳应用溶液状的分离介质只需对浓的含甲基纤维素的分离溶液进行一系列的稀释,按照设定的程序自动分析即可得到Ferguson图。

  3.3在核酸研究中的应用

  核酸分离主要是将不同大小片段分开,由于含有不同个数碱基对的DNA分子(即长度不同)其荷质比相同,因而用自由溶液毛细管电泳不能将它们分离。应用毛细管凝胶电泳模式可解决这一问题。目前作为核酸分离介质的分子筛填充料有两种:一种如同平板凝胶,呈共价交联固定状;另一种为可流动的、无交联的多聚物(如聚丙烯酞胺或甲基纤维素的衍生物)。

  应用第一种填料,可进行快速、高分辨力、有效、灵敏的DNA序列测定。Smith等在1990年报道了用毛细管电泳进行快速DNA测序的方法。它们在目前商品化的DNA序列仪的基础上进行改建,用灌注凝胶的毛细管代替平板凝胶,改进了光学部分,可同时检测四种波长的荧光,光束聚焦在毛细管5即m内径上。四种反应产物混合在一起上样至聚丙烯酸胺变性凝胶;通过测定不同荧光基团标记的DNA片段,通过检测窗口的次序决定DNA序列。平板凝胶电泳每天可分析lokb,毛细管凝胶电泳可达600kb,分析速度快了数十倍。

  用甲基纤维素衍生物作为分离介质适用于分离单碱基差异的DNA片段,因而可分析引物的纯度(用于DNA测序、扩增或点突变),以及鉴定分离基因的探针和用于克隆的连接片段。应用嗅乙锭染料结合紫外检测或荧光染料花青素结合激光诱导的荧光检测,灵敏度可提高上千倍(nx10mol.,一5fg),因而可以诊断遗传疾病,分析特殊染色体的基因谱图乃至法医学鉴定。但这一方法用来分离含几千以上碱基的DNA片段尚有困难。

  3.4.用于其它分子分析

  应用毛细管凝胶电泳结合激光诱导荧光检测分离经荧光标记的多聚糖混合物,具有较高的分辨力,可分离多聚半乳糖醛酸部分水解产生的含不同个数单糖的一系列聚合物。

  应用MECC可进行兴奋剂分析,在一次电泳中能将以下几种兴奋剂分离:苯丙醇胺、麻黄碱、安非他命、Mephentermine、可卡因、脱氧麻黄碱。1994年美国世界杯足球赛中著名球星马拉多纳被查出服用的兴奋剂即为麻黄碱及其类似物。感冒药康泰克中则含有苯丙醇胺。

  4.前景

  毛细管电泳今后发展的方向仍是提高分辨力和速度,以满足生命科学研究日新月异发展的要求,另外将它与质谱仪更好地结合,可对生物分子特性作出更快、更准的分析,并能拓宽毛细管电泳的应用领域

  生命科学毕业生论文【二】

  [摘要] 目的 了解大鼠对于人胎盘间充质干细胞是否存在天然免疫耐受,分析人胎盘间充质干细胞在大鼠体内出现免疫排斥的可能。 方法 分离提取并鉴定人胎盘间充质干细胞,观察大鼠尾静脉移植人胎盘间充质干细胞后有无出现相关的免疫排斥症状、细胞在大鼠体内的分布情况及脏器的病理改变。 结果 大鼠尾静脉移植人胎盘间充质干细胞后未出现急慢性免疫排斥反应,肝、肾、肺可见标记后的人胎盘间充质干细胞的分布,但相关病理切片未见明显的淋巴细胞浸润和纤维组织增生现象。 结论 人胎盘间充质干细胞与大鼠脏器间存在天然的免疫耐受。

  [关键词] 胎盘; 间充质干细胞;免疫排斥

  近年来,由于间充质干细胞的研究(Mesenchymal stem cells,MSCs)逐步深入,人们对间充质干细胞移植治疗大面积骨缺损[1-2]、神经系统损伤[3]、卵巢早衰[4]等疾病产生了浓厚的兴趣,而在种类众多的间充质干细胞中,人胎盘来源的间充质干细胞被认为是免疫原性最低的干细胞之一[5-6],也是目前研究的热点之一,学者们多通过大鼠移植人胎盘间充质干细胞来进行相关疾病的研究[7-10]。然而,对于人胎盘间充质干细胞是否在人鼠间中存在天然的免疫耐受,尚无相关的动物实验基础。因此,为了了解人胎盘间充质干细胞移植对大鼠各脏器功能的影响,客观的分析人胎盘间充质干细胞在大鼠体内出现免疫排斥的可能,避免由于免疫的因素掩盖或降低甚至误导了研究因素的作用,我们对正常大鼠卵巢尾静脉注射移植人胎盘间充质干细胞做了一个初步的研究。

  1 材料与方法

  1.1主要试剂

  DMEM-F12培养基(hyclone)、胰酶(hyclone)、胎牛血清(hyclone)、CO2培养箱(日本三洋)、流式细胞仪(FACSCALIBUR),PKH26试剂盒(sigma)(089K0781)。

  1.2 方法

  取足月剖宫产分娩的健康胎儿的胎盘,在无菌条件下剪取小块蜕膜侧胎盘组织,进行人胎盘间充质干细胞的原代培养。取第2代的胎盘间充质干细胞,胰酶消化后制成单细胞悬液,采用流式细胞仪进行胎盘间充质干细胞免疫表型分析。PKH26标记胎盘间充质干细胞,按sigma公司的说明书进行操作。实验分两组,每组10只大鼠,为wista近交系大鼠,体重180~200 g。第一组为对照组,不做任何处理;第二组为尾静脉注射组。移植成功后观察在大鼠体内的分布状况和大鼠一般情况的观察,评估PKH26标记的胎盘间充质干细胞在大鼠体内移植的安全性和可行性。

  2 结果

  2.1胎盘间充质干细胞的形态观察及生长情况

  分离出的胎盘间充质干细胞贴壁生长,细胞呈长梭形,类似于成纤维细胞样,见胞浆突起,胞浆丰富,核大,呈平行排列或旋涡状生长,细胞增殖活跃,约3~4 d 即可铺满全层,可稳定传代。见图1。

  2.2 胎盘间充质干细胞免疫表型分析

  取第2代细胞进行流式细胞仪检测,结果发现胎盘间充质干细胞表达 CD29,CD44,CD73,CD90、CD105;不表达CD14,CD34(造血干细胞抗原),CD45(白细胞共同抗原)、CD106、CD133和HLA-DR(MHC-II),提示所得贴壁细胞为人间充质干细胞, 表达间充质细胞特异性抗原标志而不表达造血干细胞、内皮细胞特异性抗原。见图2。

  2.3 胎盘间充质干细胞标记结果

  细胞标记后染料在细胞膜上分布均匀一致,在倒置荧光显微镜下呈红色荧光,细胞轮廓清晰。标记百分率为100%。台盼蓝染色细胞的存活率为99%。见图3。

  2.4 大鼠移植胎盘间充质干细胞情况

  移植组大鼠进食、活动、大小便均与对照组无异,未发现大鼠出现嗜睡、呕吐、抽搐、猝死、无尿、精神状态异常及偏瘫等有关器官栓塞的症状,亦未发现大鼠出现呼吸困难、出血、脱毛、血尿、血便等急慢性免疫排斥反应。

  2.5大鼠体内的胎盘间充质干细胞的分布

  荧光显微镜下可见PKH26标记后呈红色荧光的胎盘间充质干细胞,均匀分布在肺脏、肝脏及肾脏皮质。肝脏组织可见均匀分布红色荧光,整个肝脏结构组织清晰可见,包括肝脏的胆管和肝脏大血管均可见;在肾脏中亦可见红色荧光细胞主要分布在肾脏皮质,部分肾小体轮廓清晰可见。见图4。

  2.6 大鼠相关脏器的病理切片

  移植组大鼠肝、肾、大脑、膀胱HE染色后未见明显淋巴细胞浸润和组织结构的破坏,与正常组大鼠未见明显区别。见图5。

  3 讨论

  间充质干细胞具有多向分化潜能,在体外特定的诱导条件下能向成骨细胞、成软骨细胞、成脂肪细胞、骨髓基质甚至肝脏细胞和神经细胞等分化,是目前细胞治疗、基因治疗中理想的种子细胞,在神经系统损伤、卵巢早衰、糖尿病、骨缺损等疾病的治疗中具有极大的应用前景。而在众多种类的间充质干细胞中,尤其以胎盘来源的间充质干细胞优点突出,如来源丰富,易采集,病原微生物感染率和免疫原性较低,无致瘤性和伦理限制等成为目前研究的热点。

  然而,国内外学者对于间充质干细胞治疗相关疾病的机制研究,多采用动物模型进行实验,虽尚未见急慢性免疫排斥的报道,但并不代表着大鼠对于人胎盘来源的间充质干细胞存在天然的免疫耐受,因为实验中的大鼠多为相关疾病的模型,非正常状态下大鼠。钟志年等[11]选择胎盘间充质干细胞,测定其细胞周期及凋亡率情况,原子力显微镜观察细胞的表面结构,及向成骨细胞诱导分化,探讨胎盘间充质干细胞生物学特性和超微结构,并评价其在骨组织工程学中修复重建的应用前景,结果表明人胎盘间充质干细胞为成纤维细胞样,增殖能力强,9.7%的细胞处于G2/M期或者S期,微结构分析显示其细胞代谢活跃,黏附能力强,能被诱导分化为成骨细胞,结论认为人胎盘间充质干细胞具备适合应用于骨组织工程学的良好生物学特性,并避免了免疫排斥和伦理问题,可望成为骨组织修复重建中的一个新的治疗途径。本次研究我们选择了正常的成年大鼠,移植前后均未用任何药物进行免疫干预。

  事实上,人间充质干细胞用于实验动物研究的结果不令人满意,所以近年来有学者使用大鼠胎盘来源的间充质干细胞用于动物实验研究。刘志鹏等[12]通过胶原酶消化法从大鼠胎盘分离并得到间充质干细胞,并建立从大鼠胎盘分离间充质干细胞的方法,观察其基本生物学特性,结果表明,原代细胞培养8 h后细胞贴壁,24 h内细胞形成集落,第4代细胞大小、形态基本一致,以梭形为主,细胞周期检测提示G0/G1期、S期、G2期的比例分别为83.76%,8.01%,8.23%,免疫表型分析其表达CD29和CD90,不表达CD45,结论认为胎盘间充质干细胞具有成脂和成骨分化的潜能。

  本研究结果也显示大鼠尾静脉移植人胎盘间充质干细胞后1个月,大鼠肺、肝、肾等组织均可见标记了PKH26的人胎盘间充质干细胞的分布,说明移植的人胎盘间充质干细胞在大鼠体内可成功存活。病理切片也显示脑、肝、肾、膀胱等脏器未见明显的淋巴细胞浸润和纤维组织增生现象,说明人胎盘间充质干细胞的移植未对大鼠相关脏器产生免疫排斥影响。整个观察期间大鼠均无明显的急慢性的免疫排斥反应,如呼吸困难、出血、脱毛、血尿、血便等,以上结果均证明大鼠对人胎盘来源的间充质干细胞存在天然的免疫耐受。

  这种免疫耐受有可能源于胎盘间充质干细胞的低免疫原性甚至是无免疫原性。原因可能与以下因素有关:①胎盘在母儿体内起着重要的免疫屏障和激素分泌的作用[13],所以胎盘来源的间充质干细胞从理论上讲免疫原性更低,甚至不排除无免疫原性的可能,并且其分泌的免疫调节活性因子,对免疫功能排斥具有调节作用。②人胎盘间充质干细胞的HLA-DR表面标记阴性。HLA又称移植抗原,能启动免疫应答,参与T细胞的分化,诱导免疫应答,胎盘间充质干细胞的HLA-DR表面标记阴性提示了其低免疫原性的部分原因。因此,人胎盘间充质干细胞在研究相关疾病的动物模型中,即便是人-鼠间的异种间移植,但由于存在天然的免疫耐受,对实验研究的结果影响甚小。


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