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测序论文写作

2017-07-31 11:20 本文地址:http://www.qwqk.net/news4823.html 人气:1558

测序类的论文在一些行业中有重要的意义,在写作方面也有一定的规范。

  测序论文范文篇一

  【摘要】   目的:为了寻找肿瘤特异凋亡蛋白,克隆鸡法氏囊组织中鸡贫血病毒Apoptin蛋白的编码基因并进行序列分析. 方法:根据基因数据库资料设计合成引物,以成鸡法氏囊组织中提取的DNA作模板,通过PCR获得了特异扩增产物,将其插入到pGEMTeasy载体并转染感受态E.coliDH5α菌株,提取质粒经限制性内切酶酶切鉴定后,使用DNA测序仪测定插入片段的DNA序列. 使用DNAsis分析软件分析所克隆的DNA序列及其编码蛋白质,并与数据库中Apoptin蛋白的编码基因相比较. 结果:序列分析表明,成功地克隆了鸡贫血病毒的Apoptin基因,同基因数据库中的相关资料比较发现与山东报道的Apoptin基因(GenBank AY171617)的核酸序列一致,同鸡贫血病毒全基因序列中的Apoptin序列(GenBank AF 313470)有6个核酸差异. 结论:Apoptin编码基因的克隆为特异诱导肿瘤细胞凋亡治疗肿瘤奠定了基础.

  【关键词】 鸡贫血病毒 凋亡素 克隆 测序

  0引言

  鸡贫血病毒(chicken anemia virus, CAV)是由DanenVan Oorschot等[1]在1979年发现并能引起雏鸡贫血死亡的一种环状病毒.CAV基因组长度约2.3 kb[2],能分别编码VP1,VP2和VP3三种蛋白质. 其中VP3蛋白是功能蛋白质,由121个氨基酸组成,它包含两个富含脯氨酸的序列和两个带正电的区域,具有诱导被感染鸡血细胞凋亡的活性,是鸡贫血病毒的主要致病因子,根据此特性将该蛋白命名为凋亡素(Apoptin)[3]. 在Apoptin诱导肿瘤细胞发生凋亡的作用机制研究方面已取得较大进展[4], Apoptin能特异性诱导肿瘤细胞和转化细胞调亡,其发生作用不依赖p53基因,而且不被Bcl2过表达所抑制,因此这种Apoptin可能成为一种很有前途的能选择性地诱导肿瘤细胞和转化细胞发生凋亡的药物.

  本研究旨在从自然生长的家鸡法氏囊中分离、提取CAV DNA,通过PCR方法扩增CAV的Apoptin编码基因,将其插入克隆载体PGEMT中,使用双脱氧终止法测定插入片段的DNA序列,同Genbank的数据库比较证实获得了CAV的Apoptin编码基因克隆,为研究Apoptin治疗肿瘤奠定了基础.

  1材料和方法

  1.1材料4只低体质量(<1400 g),低产卵的3月龄雌鸡(购于西安市郊区某鸡场);PGEMT质粒、E.coliDH5α(西安市华广生物工程有限公司实验室提供). 耐热的TaqDNA聚合酶、各种限制性内切酶、DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、蛋白酶K, DNA Mr标准,华美生物公司;E.coliDH5α受体菌,华广生物工程公司.

  1.2方法

  1.2.1病毒DNA提取将鸡颈静脉放血处死,立即分离法氏囊,置液态氮冷冻保存;取100 mg冷冻组织,在1 mL的匀浆缓冲液(50 mmol/L TrisHCl, 100 mmol/L NaCl, 2 mmol/L EDTA, pH 8.0)中制备组织匀浆;取500 μL匀浆加入SDS和蛋白酶K,使其终浓度分别为1和200 mg/L,37℃温育120 min消化组织蛋白,消化后加入等体积的酚和氯仿/异戊醇各抽提一次,收集上清液加入RNase,37℃温育60 min,再次用酚和氯仿/异戊醇各抽提,加入二倍无水乙醇沉淀,收集沉淀使用700 mL/L乙醇洗涤后干燥,使用100 μL TE缓冲液溶解备用.

  1.2.2引物的设计根据GenBank发表的CAV基因序列设计扩增引物. 正向引物5′CGG CCG GCG TGG GAT GAA CGA TCT CCA AGA AGA TAC3′,   反向引物5′CAA GCT TCA GTC TTA TAC GCC TTC TTG CGG TTC3′. 粗斜体表示在正向引物和反向引物的5′端加入的Nae I 和Hind III酶切位点,在正向引物和反向引物中分别加入了CG和C保护碱基. 为了作Apoptin同相关蛋白的融合表达在反向引物3′端删除了终止子.

  1.2.3PCR反应将上述目的基因进行PCR扩增,反应参数为:94℃ 5 min预变性, 94℃ 60 s, 60℃ 60 s, 72℃ 90 s,循环30次后,72℃延长5 min;PCR产物的鉴定与回收及同线性载体pGEMT连接、受体菌的转化按常规分子生物学方法进行.

  1.2.4阳性重组子的筛选与鉴定转化菌涂在含氨苄青霉素的加入X gal和IPGT的LB平板上,挑取白色菌落,扩增后提取质粒,EcoR I酶切后,琼脂糖凝胶电泳.

  1.2.5序列比较分析选取阳性重组克隆,由上海基康公司帮助测定插入片段序列. 插入片段同CAV Apoptin基因序列的一致性和编码蛋白质的分析使用DNAsis 2.5软件完成.

  2结果

  2.1PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR扩增产物(366 bp)与目的片断相吻合(图1).

  2.2重组质粒pGEMT/Apoptin的酶切鉴定重组质粒pGEMT/Apoptin经EcoRⅠ酶切琼脂糖凝胶电泳得到2659 bp和约400 bp(393 bp)的两片段, 后者与目的片断大小一致(图2).

  2.3重组pGEMT/Apoptin质粒中的Apoptin基因测序对获得的重组质粒进行DNA序列测定,测定的结果表明插入片段与设计片段序列完全一致,无碱基突变和读码框移位.

  2.4克隆Apoptin编码基因分析同GenBank AF 313470比较,本研究克隆的CAV Apoptin基因序列有6个核酸变异;同文献报道的Apoptin基因序列AY171617一致.

  3讨论

  Apoptin是CAV的VP3蛋白基因编码的一种蛋白质,这种蛋白能特异性地诱导肿瘤细胞和转化细胞调亡,因此人们也称其为凋亡素-Apoptin,其发生作用不依赖p53基因,也不能被Bcl2过表达所抑制,有可能成为研究肿瘤细胞凋亡和抗肿瘤药物很有用的一个靶分子.

  为了证实克隆的基因是否为Apoptin基因,将其与GenBank数据库中相关基因进行比较,发现与GenBank数据库中登录的46株CAV的VP3基因的同源性至少为98%,证实了克隆的DNA片段确为Apoptin基因. 同时将克隆的VP3基因ORF推导得到的蛋白质一级结构与GenBank数据库中相关蛋白质进行比较,发现与GenBank数据库中收录的29株CAV的凋亡素氨基酸序列的同源性至少为82%. CAV是一种比较保守的病毒[5],目前仅发现一种血清型. 凋亡素分子的118位氨基酸,所有报道的序列中几乎一半为Cys,一半为Arg. 实验证明,这一变化对凋亡素活性影响似乎比较大,当这个位点的Arg变成Cys时,CAV在传代细胞中的传代效率降低,而且将降低凋亡素的核定位能力,表现为存留在胞质中的凋亡素量将超过细胞核的量,进而将降低其诱导细胞凋亡活性. 我们克隆的VP3基因编码的蛋白质是118 Arg,因此可能具有较强的诱导肿瘤细胞凋亡的活性. 凋亡素可能是通过一种与大多数功能蛋白质不同的作用机制来发挥其诱发肿瘤细胞发生凋亡作用的,凋亡素在发挥功能时可能并不以单体的形式存在,而是与其他成分结合,或与自身成分形成异源或同源多聚体来发挥其功能. Leliveld等[6]将麦芽糖结合蛋白(maltose bindingprotein, MBP)与凋亡素分子连接,构建了一个可溶性的重组凋亡素蛋白融合体(MBPApoptin),经反复试验证明MBPApoptin是一个由30~40个亚基组成的稳定、均一在体内有活性的球形多聚体复合物;Zhang等[7]通过显微注射手段将MBPApoptin分别注射到肿瘤细胞和正常细胞中,结果证实MBPApoptin在肿瘤细胞中具有显著的效价和特异性,而在正常细胞中细胞抗原表位被保护,MBPApoptin汇集成高级聚集体,最终在细胞质中被蛋白酶降解而消失[8]. 由于VP3基因编码的凋亡素蛋白Apoptin具有很高选择性,这些特性进一步增强了凋亡素作为抗肿瘤药物的安全性. 从而有望解决肿瘤治疗中高效性和特异性难于统一及易产生耐药性等难题. Apoptin将是一种非常有前景的抗肿瘤制剂,它的开发利用必将会产生巨大的经济效益和社会效益.

【参考文献】

  [1] DanenVan Oorschot AA, van Der Eb AJ, Noteborn MH. The chicken anemia virusderived protein apoptin requires activation of caspases for induction of apoptosis in human tumor cells[J]. J Virol, 2000, 74(15): 7072-7078.

  [2] Phenix KV, Meeha

  测序论文范文篇二

  临床分离嗜麦芽寡养单胞菌L1、L2酶基因克隆、测序及定位

  【关键词】 β

  摘要: 目的 了解临床分离嗜麦芽寡养单胞菌产L1、L2 β内酰胺酶情况、酶基因定位及核苷酸序列进化和同源关系。方法PCR法扩增两种β内酰胺酶基因,通过克隆、测序、序列比对确定其亚型、基因进化、同源关系和基因所在位置。结果 细菌染色体DNA和质粒DNA扩增L1、L2酶基因阳性,其序列具有明显异质性,两种酶基因位于12kb大小的质粒上。结论 嗜麦芽寡养单胞菌绝大多数产生两种β内酰胺酶,酶基因变异和进化加速的驱动力部分可能与β内酰胺类抗生素的长期使用有关。

  关键词: β内酰胺酶; 异质性; 质粒

  Cloning, sequencing and location of genes encoding L1 and L2 βlactamases

  ABSTRACT Objectives To investigate the production of L1 and L2 βlactamases, location and evolution or homology of nucleotide sequences of their encoding genes in clinical isolates of Stenotrophomonas maltophilia.Methods Two βlactamasesencoding genes were amplified by PCR. The subtypes, evolution or homology and location of genes were determined by gene cloning, sequencing and sequences contrasting. Results L1 and L2 genes in chromosomes and plasmids were amplified, the gene sequences were apparently heterogeneous and the genes were located on 12kb plasmid. Conclusion Majority of Stenotrophomonas maltophilia isolates produced two βlactamases. Gene variation and evolution acceleration partly contributed to longtime uses of βlactams.

  KEY WORDS βlactamases; Molecular heterogeneity; Plasmids

  嗜麦芽寡养单胞菌(又称嗜麦芽窄食单胞菌)为机会致病菌,广泛分布于自然界,医院环境和医务人员皮肤分离率较高。随着医源性介入技术的应用、免疫抑制病人的增加以及抗生素的大量使用增加了该菌的感染机会。该菌耐药性强,对临床多种抗生素包括多数β内酰胺类耐药,是目前医院内感染的重要致病菌之一,对β内酰胺类抗生素耐药主要因该菌产生两种β内酰胺酶(L1和L2酶)所致。本文从临床标本中收集13株嗜麦芽寡养单胞菌,研究其产两种β内酰胺酶的情况及酶基因位置,探讨耐药性产生的原因。

  1 材料和方法

  1.1 菌株 所有菌株来源于2003年3月~2004年7月解放军总医院的临床标本,由该院微生物科分离、培养、鉴定并保存。本次实验前所有菌株均经VITEK微生物鉴定系统重新鉴定,药敏试验应用复方磺胺甲口恶唑(SMZ/TMP)、亚胺培南(IMP)、左氧氟沙星(LVLX)和头孢他啶(CAZ)4种抗生素纸片并采用纸片扩散法进行常规药敏试验, 耐药的判定点参照CLSI/NCCLS(2000年)标准。质控菌株为铜绿假单胞菌ATCC27853和大肠埃希菌ATCC25922。

  1.2 质粒DNA的提取将13株临床菌株37℃过夜培养后,分别挑取1~2个菌落接种在5ml LB培养基中,220r/min 37℃恒温摇床孵育12h,采用碱裂解法抽提质粒DNA[1],粗提物5μl直接加样于08%琼脂糖凝胶上电泳检测,溴化乙啶染色后收集图像。

  1.3 染色体DNA的提取取上述菌液2ml采用天为时代离心柱型细菌基因组DNA提取试剂盒提取染色体DNA。

  1.4 L1、L2酶基因的PCR扩增所有分子生物学试剂除特别注明外,均购自大连宝生物工程有限公司。根据GenBank注册的两种β内酰胺酶全基因序列设计L1酶PCR引物(注册号X75074),扩增873bp的编码序列。L2酶PCR引物(注册号Y08562),扩增长度为905bp。引物由上海生工生物公司合成。L1F:5′ATGCGTTCTACCCTGCTCGCCTTCGCC 3′L1R:5′TCAGCGGGCCCCGGCCGTTTCCTTGGCCAG3′L2F:5′CGATTCCTGCAGTTCAGT3′L2R:5′CGGTTACCTCATCCGATC3′PCR反应条件:反应体积为50μl,含10×LA缓冲液5μl,MgCl2 5μl,dNTP各8μl,LA DNA聚合酶25U,基因组DNA模板10μl,引物(20μmol/L)1μl,双蒸水195μl。扩增L1的条件为:94℃预变性4min,然后94℃ 1min,68℃ 1min,72℃ 1min,共30个循环,最后72℃延伸5min。扩增L2的条件为:94℃预变性5min,然后94℃ 30s,55℃ 30s,72℃ 50s,共30个循环,最后72℃延伸7min。制备10%琼脂糖凝胶,PCR产物在1×TAE电泳缓冲液中电泳,溴化乙啶染色,用紫外透视仪观察结果,收集图像。

  1.5 PCR产物的纯化、克隆及测序PCR产物电泳后,切胶回收纯化目的条带,然后将目的基因与pMD18T载体连接,连接反应液转化至经氯化钙制备的大肠埃希菌DH5α感受态细胞中,经含氨苄西林(100μg/ml)的LB培养基进行蓝白斑筛选,挑取白色菌落涂布平板,37℃过夜孵育,次日经PCR法筛选阳性菌落并接种在LB培养基中,振摇16~18h,提取质粒。以重组质粒为模板,pMD18T载体的通用引物(M13)为引物由上海华诺生物科技公司用ABI PRISM 377 DNA测序仪进行双向测序,测序结果在GenBank中进行序列比对分析。

  1.6 L1、L2编码基因的定位13株嗜麦芽寡养单胞菌质粒电泳后回收不同大小的质粒DNA片断,再分别作为模板,以L1、L2引物进行PCR扩增(反应体系及扩增条件同前),对两种酶基因进行定位。

  1.7 序列比对和分子进化树构建应用BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)对测序结果进行检索并比对;应用Clustal W(http://www.biosoft.net)分别构建两种酶的分子进化树,进化树的核苷酸序列有L1a X75074;L1b AF010282;L1c AJ251814;L1d AJ251815;L1e AJ277109;ULA511L1 AJ291672;L2a Y08562;L2b AJ251816;L2c AJ251817;L2d AJ272110;ULA511L2 AF299368,以及临床分离菌的测定序列。

  2 结果

  2.1 药敏实验结果表1提示所有菌株对亚胺培南耐药;对复方磺胺甲口恶唑和左氧氟沙星敏感性较高,在半数以上;对头 表1 临床分离13株嗜麦芽寡养单胞菌的部分临床特点及药敏结果 年龄

  2.2 质粒谱分析除1株外均发现约12kb左右的质粒,其中2株有接近2kb的质粒条带,另外一株在12kb以上还有2条带。图1示提取的质粒经琼脂糖凝胶电泳后的情况。

  2.3 PCR扩增和基因克隆结果以细菌染色体DNA为模板,扩增L1、L2基因的结果显示,L2基因均为阳性(905bp);L1基因有2株为阴性,11株菌为阳性(873bp)(图2)。

  2.4 重组质粒的构建和PCR鉴定结果将L1、L2基因的扩增产物分别连接到pMD18T载体后转入DH5α感受态细胞中,经PCR鉴定重组质粒产生的片段分别为873和905bp,符合L1、L2基因的扩增片断大小。

  2.5 测序结果对PCR扩增L1基因阳性的11株菌随机选取9株进行测序,其结果经GenBank网上同源性比较,L1基因序列未见完全一致者。其中,1株(4号菌)与ULA511(注册号Aj291672)的序列有2个氨基酸的改变,同源性最高为993%(在第3位由苯丙氨酸→丝氨酸,第284位由精氨酸→赖氨酸);与Avison[2]分类的L1b的同源性为99%(在289位由苏氨酸→丙氨酸);另外1株(10号菌)与L1d的同源性为921%,有23个氨基酸的改变,其他菌株与L1c均有较高同源性。对PCR扩增L2基因阳性的13株菌随机选取3株进行测序,L2基因的序列有1株(2号菌)与L2b氨基酸同源性为100%,与ULA511菌株的L2基因(注册号AF299368)同源性997%。图3分别显示两类酶的同源关系及系统进化树。

2.6 L1、L2基因的定位分别以不同大小的质粒为模板,以L1、L2引物进行PCR扩增,结果12kb的质粒扩增到阳性片断,分别为873和905bp(图4)。

  2.7 L1、L2基因的进化应用Clustal W构建的分子进化树如图3。进化树可直观的表示各种酶的进化关系,树枝长度反映进化图2 以染色体为模板扩增L1、L2基因的电泳图距离或同源性。图3a表明除4、10号菌的L1基因外,多数临床分离菌的L1酶基因与L1c同源性高;从进化距离看出它们从共同祖先分歧时间相近。图3b表明所测序的3株菌与L2b和ULA511的同源性高,而所有菌株与L2d的同源性均低。

  3 讨论在Zhang[3]、Denny[4]等报道中,嗜麦芽寡养单胞菌对多种抗菌药物以及一些消毒剂表现出耐药性,其机制可能与产生水解酶、渗透屏障、外排系统以及变异迅速等有关。以往认为两种β内酰胺酶的产生是嗜麦芽寡养单胞菌对碳青霉烯类和β内酰胺类耐药的主要原因,而本研究的13株菌药敏结果显示,所有菌株对亚胺培南耐药,但PCR扩增L1酶基因发现有2株菌a:L1; b:L2PCR扩增结果为阴性,说明产生L1水解酶并不是碳青霉烯类耐药的惟一因素。另外13株菌的临床资料表明,绝大多数患者年龄在60岁以上,有些甚至为高龄或有严重基础疾病者,多数患者近期使用过β内酰胺类抗生素1周以上,提示高龄、体弱、免疫力低下以及有严重基础疾病或长期使用β内酰胺类抗生素为该菌感染的易感因素。细菌质粒DNA电泳发现,12株菌携带12kb大小的质粒,L1、L2基因位于该质粒上,与文献报道的L1、L2基因位于200kb质粒上不同[2]。位于质粒上的耐药基因可发生横向传播导致感染的暴发流行,给抗感染治疗造成极大威胁。本实验中细菌染色体DNA扩增L1、L2基因也为阳性,根据文献报道的该菌含有片断性染色体[5],因此有学者推测,提取的这些质粒样元件可能为片断性染色体的一部分。本研究扩增的两类酶基因除一株L2基因(4号菌)与L2b基因的氨基酸同源性为100%,核苷酸序列有2个碱基的改变外,其余多数在70%~90%之间,表现为明显的异质性。异质性的产生可能与长期使用β内酰胺类抗生素有关[2,6]。根据L1、L2核苷酸序列以进化树形式确定其同源关系,有助于明确其亚型和确定各类酶的特点。图3a中10号菌的L1酶与L1d、4号菌的L1酶与ULA511及L1b、5号菌的L1酶与L1c的同源性较高,L1e与其他酶的相似程度较低,显示了不同于其他类型酶动力学参数[2]。L2酶中测序的3株菌的序列与L2b均有较高同源性,而与L2a、L2c、L2d的同源性较低。树状图可较好地反映酶序列的亲缘关系或进化程度并能将新发现的酶进行归类。综上所述,本实验以临床分离的嗜麦芽寡养单胞菌为研究对象,分别以细菌染色体DNA和质粒DNA为模板扩增了两种β内酰胺酶基因,发现两种酶基因表现为明显的异质性,其酶基因的变异和加速进化的驱动力部分可能与β内酰胺类抗生素的使用有关。另外,本实验结果显示两种β内酰胺酶基因位于12kb大小的质粒上,但该质粒与染色体DNA的关系尚待进一步证实。

  参考文献

  [1] 黄培堂等译. (美)萨姆布鲁克(Sambrook,J.)等著. 分子克隆实验指南[M].第三版. 北京:科学出版社,2002:27

  [2] Avison M B, Higgins C H, Heldreich C J, et al. Plasmid location and molecular heterogeneity of the L1 and L2 βlactamase genes of Stenotrophomonas maltophilia [J]. Antimicrob Agents Chemother,2001,45:413

  [3] Zhang L, Li X Z, Poole K. Multiple antibiotic resistance in Stenotrophomonas maltophilia: involvement of a multidug efflux system [J]. Antimicrob Agents Chemother,2000,44:287

  [4] Denny B, West P, Panigrahi D. Effects of permeabilizers on antimicrobial susceptibility of Stenotrophomonas maltophilia and Acinetobacter spp. [J]. J Microbiol Immunol Infect,2003,36:72

  [5] Lee N R, Hwang M O, Jung Y S, et al. Physical structure and expression of the alkBA encoding alkane hydroxylase and rubredoxin reductase from Pseudomonas maltophilia [J]. Biochem Biophys Res Commun,1996,218:17

  [6] Sanschagrin F, Dufresne J, Levesque R C. Molecular heterogeneity of L1 metalloβlactamase family from Stenotrophomonas maltophilia [J]. Antimicrob Agents Chemother,1998,42:1245


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